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MultiNA有效提高Cas9检测灵敏度和编辑效率评估

MultiNA有效提高Cas9检测灵敏度和编辑效率评估


从锌指核酸酶内切酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)到第三代基因组定点编辑技术CRISPR/Cas9,再到5月份中国河北科技大学韩春雨老师发表在Nature Biotechnology上采用的NgAgo/gDNA方法,基因编辑技术受到的关注与日俱增。在“如何进行基因编辑”这个问题被解释得不能再详细的时候,我们是不是应该考虑一下,如何评价基因编辑的结果呢?今天,我们就来说说评估基因编辑效率的方法。

首先,咱们来看看基因编辑之后,在基因组上都会发生哪些事情:

1.  首先,工具分子切割目的基因后,会在靶点留下双链断裂(DSB);

2.随后,细胞会针对DSB做出三种不同的修复方式:

① 完美修复:由同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)方式进行的无痕修复。这类修复发生时,相当于基因序列没有发生变化,因此是不能检测到基因编辑效率的;

②  插入修复:基于HR原理,并利用外源导入的Donor模板完成的序列插入修复。这类修复发生时,在靶点处会多出一段序列,相当于完美地向基因组中整合了另外一段基因序列,并且可以通过DNA测序进行检测;

③ 随机修复:基于NHEJ原理发生的错误修复。这类修复导致的后果可以说非常复杂,既可以是碱基插入,也可以是碱基缺失,而且数量随机,毫无规律可循,因此是较难检测一种基因编辑结果;

目前,用于分析基因编辑实验结果的方法主要有大批量亚克隆PCR产物Sanger测序、HRM分析、二代测序(NGS) 和数字PCR(GEF-dPCR)方法。然而这些方法均有令人烦恼的短板,如Sanger测序法耗时太久,HRM分析、NGS和GEF-dPCR对设备、样品、实验成本及数据量有较为苛刻的要求。
那到底有没有一种既花费成本低、又比较可靠的方法和工具呢?

答案是肯定的!

下面介绍一种,利用异源双链泳动实验(HMA)来检测上述基因编辑效率的工具:高灵敏、自动化微芯片电泳系统。

HMA的实验流程

异源双链DNA依赖于分子量进行电泳泳动,同时异源双链部分区域发生错配,导致与同源双链的结构差异,空间结构也会影响泳动速率,因此,通过分离异源双链与同源双链,微芯片电泳系统可以检测有没有发生突变。

检测步骤:

1. 运用基因编辑工具将野生型小鼠基因改造成多色F0代小鼠:

2. F0 与野生型回交,形成野生和杂合F1代:

3. F1自交形成野生、纯合变异、杂合F2代:

4. 取F0、F1、F2代小鼠,对发生突变的目的基因片段进行PCR;

5. 在热循环中,将PCR产物进行热变性与冷复性,制作出异源双链DNA;

6. 用微芯片电泳系统分离检测异源双链DNA;

(在热变性、复性之后,由两种结构的PCR产物变成4种结构的PCR产物)

HMA-MultiNA微芯片电泳检测结果

F0代TALEN突变形成评价

注:活性百分比为B/A的相对活性

HMA-MultiNA检测是用两种类型TALENS来处理相同基因四个个体。当多色个体用HMA来检测时,因为大量异源双链的出现,在野生型条带的上面有弥散的条带类型,所以,通过计算野生型条带的数量以及弥散条带的数量比值,即得到TALEN突变率。在此结果中,实验二野生型条带含量低,所以可知TALEN 2的体内活性更高。

F1代HMA-MultiNA与测序结果对比

F1代有多样的条带缺失大小,条带类型也很多。通过HMA-MultiNA检测结果如上图左,缺失片段的测序结果如上图右。可知,HMA-MultiNA可以在175bp的产物大小中检测到2bp的缺失,同时直接检测到4bp缺失片段的纯合变异体,此外有可能从条带类型得到缺失条带大小。

F2代HMA-MultiNA基因分型

结果可知,异源双链中的一条链有8bp的缺失,可以清晰的分离开杂合体的四种条带。同时,从条带分离中,可以确定野生型和纯合突变体。
即使变异程度很小,很难判定哪个是纯合突变体,仍然可以利用野生型的PCR产物加入到表示单独条带的PCR产物中,进行第二次HMA实验,来再次检测异源双链DNA,以发现具有很小缺失的纯合突变体。

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MultiNA是将先进的微芯片技术和自动化分析技术完美结合,缔造出的全新DNA/RNA快速分析系统,2007年度获得世界十大新产品奖。与传统的琼脂糖电泳技术相比,费用更低、速度更快、灵敏度更高,使电泳分析进入新境界。 为生命科学带来了突破性的变革!

2015年,MultiNA已经越来越广泛用于基因编辑领域,在日本市场,已售出200台。

MultiNA微芯片电泳系统特点:

1、  LED激发荧光检测器,灵敏度是传统方法的10倍;

2、  芯片既可做DNA样品,又可做RNA样品,可重复使用;

3、  最多支持4张芯片同时工作,大大提高工作效率;

4、  单管、8边管、96孔板均可自由独立取样分析;

5、  配套高品质试剂保持期长,分析成本低;

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如需试用或试样请随时与我们联系:

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