微芯片电泳在二代测序（NGS）文库质控的应用
随着测序价格不断降低，NGS的应用现在可以说是如日中天了，市场中主流NGS系统，如Hiseq，Solexa，454等，越来越多的进入到大家的视野中。为了得到良好准确的测序结果，NGS前要求了解测序文库样品的尺寸分布和浓度，以提高测序的准备性、减少测序过程中不必要的尝试、降低测序成本。
传统的方法是使用琼脂糖凝胶电泳获得文库的尺寸分布，文库的浓度信息则是通过实时荧光PCR或分光光度计获得。这样的操作需要一系列的步骤、繁琐费时、效率低下、成本居高不下。
另外，随着测序技术的成熟，需要进行质量控制的文库数量大大增多！
本文承接上文，继续介绍微芯片电泳在NGS文库构建中样品分析的应用，以期为大家提供一种操作简单、自动化程度高、高通高、成本可接受的方法。
分析方法（与实时PCR 的浓度定量结果的比较）：
1、利用SMARTer Ultra Low RNA kit 制备cDNA 扩增产物得到小鼠的TotalRNA
2、根据Illumina 公司的方法，分享cDNA 扩增产物后，使用TruSeq DNA sample prep kit 制备NGS 文库
3、使用微芯片电泳系统及自带弥散（smear）分析软件分析同一文库，同时对浓度进行定量
4、微芯片电泳系统的浓度定量结果和同一样品的实时PCR（GVP-9600 qPCR）结果进行比较
图2. NGS 流程和MultiNA 文库质量控制的应用范围
结果讨论：
在NGS文库的质量控制过程中，使用微芯片电泳的smear分析软件能够计算出文库的预计平均大小、浓度和摩尔浓度（下图）。通过与实时PCR 的定量进行比较，可知MultiNA 的定量浓度定量结果稳定（下表）。
| Library No. |
MultiNA (nmol/L) |
GVP-9600 (nmol/L) |
Ratio (MultiNA/GVP-9600) |
| 1 |
154.6 |
167.3 |
92.40% |
| 2 |
127.0 |
145.1 |
87.50% |
| 3 |
54.1 |
57.8 |
93.60% |
| 4 |
272.4 |
292.3 |
93.20% |
| 5 |
187.3 |
226.8 |
82.60% |
| 6 |
207.5 |
229.3 |
90.50% |
| 7 |
230.3 |
256.8 |
89.70% |
| 8 |
157.0 |
181.9 |
86.30% |
|
|
Average |
89.475% (CV 4.3 %) |
在小鼠的RNA 测序结果中，也得到了足够的读取长度和Index标签序列的各文库间稳定的读取率（下表）。
|
簇密度读取数
（过滤处理后）
|
548 K/mm2
143.3 M reads
|
总读取数
≧Q30 比率
|
151.5 M reads
95.90%
|
| 4 个文库的读取率 |
21.2% - 26.2%（4个文库/用Index
标签序列对1个通道排序：理论值25 %） |
|
|
注：文库制备时如果没有进行PCR，可能无法根据文库的分布数据得到理想的检测灵敏度。
由上述结果可知，不仅可以在MultiNA 的文库质量控制中确认大小分布，还能够在常规分析中同时进行定量。使用MultiNA可最多对108 个文库自动进行电泳和分析。并且，实际操作时间可缩短10～20 分钟。特别是NGS 文库有所增加时，将MultiNA应用到文库质量控制中，可快速简便地进行质量控制。
MultiNA微芯片电泳系统进行NGS文库质量控制的优点：
|
