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细胞划痕实验操作教程

      细胞划痕实验(Wound Healing)是一种操作简单,经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”,划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合,在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程,是研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

   划痕实验中,检测目标为感染病毒后表达荧光蛋白的目的细胞[不表达荧光蛋白也可以,但是图片得视觉效果不如表达荧光蛋白] (生长于96孔板中)。用专用的划痕工具制造划痕,细胞成像系统识别带绿色荧光的细胞并拍照(即读板)。然后通过软件对同一视野细胞迁移0h和x h(x为实验细胞合适的迁移时间点[时间太早,划痕愈合的效果不明显,时间太长,不同组别的划痕都愈合完成,组间看不到差异,推荐时间点为0h、8h、16h、24h、36h、48h] )后图像进行分析处理,计算出实验细胞在x h的迁移面积。


96孔细胞划痕仪

二、实验材料

1.主要试剂

胎牛血清、基础培养基、胰酶、PBS

2. 主要仪器

生物安全柜、荧光显微镜、离心机、CO2培养箱

三、实验步骤

(1)   将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液,计数;

吸弃培养基

PBS清洗

加入胰酶

终止消化

收集细胞

离心获取沉淀

细胞计数仪 (上海吉盛医学科技有限公司提供  QQ:1711332989

(2)   根据细胞大小决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为50000 cell/well,以次日细胞达到90%以上汇合度为准[细胞铺的太多,太挤,连原本细胞形态都会看不清。划的时候,也很容易划不干净,而且划完以后,两边会挂有一团团细胞,使两边边界不清晰。不同细胞,形态大小不一,铺板细胞量自然也就不一样,想要找出铺板最佳细胞量,最快捷的方法就是铺梯度。96孔板,那么多孔,足够一次铺好几个密度梯度了(3万,5万,10万,随便试) 。37℃、5%CO2培养箱培养,每组3复孔,培养体系为100 μL/孔。

划痕铺板

铺板后细胞

(3)   第二天换低浓度血清培养基.

次日细胞状态

划痕仪准备一(上海吉盛医学科技有限公司生产制造  QQ:1711332989

划痕仪准备二  (上海吉盛医学科技有限公司生产制造  QQ:1711332989

划痕  (细胞迁移-划痕实验工具单页.pdf

(4)   使用PBS轻轻漂洗2-3遍[划完以后,痕中间和培养液中遗落少量细胞,是可以通过清洗去除的(如果太多,就别挣扎了,重新再来吧),有些是已经被划动了,但没有完全划掉,这时候清洗个两三次,清洗的时候轻拍96孔板,已经被划动的贴壁不牢的细胞大多数会别洗掉。不过,对于一些本身就容易脱落的细胞,就不能这样洗了,只能“温柔以待”,以免细胞全被洗没了。] ,加入低浓度血清培养基(如1% FBS)[使用低浓度的培养基是为了防止细胞增殖对划痕结果的影响] ,0 h拍照。

清洗

低浓度血清培养基培养

(5)   37℃、5% CO2培养箱培养,根据愈合程度选择合适时间用细胞成像设备扫板。

(6)   分析迁移面积。

四、划痕数据分析概述

迁移面积=x h的细胞面积-0 h的细胞面积。


五、吉凯划痕数据分析步骤[不同的细胞成像设备使用不同的分析方法,八仙过海各显神通吧,但是整体思路就是比面积、比宽度

(1)   在0 h和x h对目标96孔板进行扫描读板,获得扫描图片;

下图为针对同一视野在迁移0 h和20 h后获得的扫描图像示例(细胞为H1299):

(2)   用YOKOGAWA CQ1激光共聚焦细胞分析仪或者带有分析功能的倒置显微镜(吉盛医学提供)对扫描图片进行分析,自动获得数据获得细胞面积。         


(3)   计算迁移面积=(S3+S4)-(S1+S2)

(4)   针对划痕预实验,根据迁移面积,判断细胞是否有愈合能力;针对划痕实验,根据迁移面积,判断相对阴性对照组,KD(或OE)组细胞愈合能力的差异。

            

       CQ1 活细胞共聚焦显微镜 (吉盛医学提供)      NIB倒置活细胞荧光显微镜(吉盛医学提供)        

六、质量控制:

1、 正式实验每个孔采集3张照片,照片要求划痕宽度基本一致,且划痕的面积内无遗留较多的细胞或者痕迹,图片中的细胞分布均匀,且无大面积的凋亡(靶点本身导致的凋亡除外);

2、 如果在实验中设置了CON(空白)组,实验中CON和NC(阴性对照)组的迁移能力要基本一致;

3、 细胞划痕预实验基本从8h,16h,24h,36h,48h这几个时间点间进行选择,但是具体进行的时间点需要根据细胞的迁移能力进行调整;报告中的图片不能在第1和第2个时间点就出现愈合。



索取资料请联系: 021-31395790  琚惠   admin_a@genechem.com.cn



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