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microRNA过表达慢病毒载体构建服务
microRNA过表达慢病毒载体构建服务
 
MicroRNA简介:
  MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据推测,miRNA调节着人类三分之一的基因。
MicroRNA有以下几种形式:
    pre-miRNA
    约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。
    primiRNA
    天然primiRNA :从染色体基因文库中调取300bp-1000bp完整的microRNA基因,克隆到质粒载体(普通载体或病毒载体),以强大的CMV启动子操 纵该300bp-1000bp microRNA。
    人工primiRNA 选择一个完整的microRNA基因,克隆到质粒载体(普通载体或病毒载体)。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA,并以pol Ⅱ/pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。
 
  pre-miRNA是最早采用的microRNA,拥有大量的成功报道。化学合成的pre-miRNA制备快捷,可以标记荧光等追踪。缺点是制备的RNA稳定性较差,而且,由于制备的microRNA较长,合成时RNA的错误难以避免(当合成RNA超过60bp时,出现一个碱基错误率约30%),转录制备的pre-miRNA稳定性较好,但无flank结构,很少使用。质粒载体形式的pre-miRNA也因为发现microRNA的flank对于microRNA功能和测定非常重要,现已逐渐被pri-miRNA取代。人工pri-miRNA效果较pre-miRNA好,也有足够多的成功使用的经验报道,但这种人工microRNA采用固定的mir155 flank,制备的microRNA功能不及天然原始microRNA,故也逐渐较少使用。原始天然pri-miRNA克隆自天然文库的microRNA由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构,效果更好,是近来被首选方法。
 
 
 
 
MicroRNA过表达慢病毒载体特点:
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
我们采用美国进口的第三代microRNA过表达慢病毒表达载体,有HIV来源的和FIV来源两种,能够高效表达出原始天然pri-miRNA和MicroRNA基因簇,详情请参见慢病毒载体信息,我们的microRNA过表达慢病毒载体具有以下特点:
 
 
 
 
一、CMV启动子高效表达出原始天然pri-miRNA,我们从人、大鼠、小鼠基因组或肿瘤组织中克隆出pri-miRNA,完全忠实细胞内的天然结构,具有更高的效率,更重要的是,它能在细胞内准确无误地表达出天然microRNA
载体表达出的pri-miRNA结构:
 
 
二、着成千上万条miRNA被鉴定出来,用microRNA干预基因功能或药物筛选的需求越来越多。由于microRNA慢病毒载体能够被包装成microRNA慢病毒颗粒,用于感染分裂期和非分裂期细胞,如原代细胞、难于转染的细胞或干细胞等,使其成为活体研究甚至基因治疗的里程碑。
 
三、microRNA慢病毒载体经可包装成慢病毒颗粒,microRNA慢病毒感染过的细胞能够长久表达miRNA,且这种表达具有可遗传性,与化学合成的miRNA或表达miRNA质粒实现的瞬时表达相比,这种特点与天然的microRNA机制更相似。
 
四、copGFP与miRNA前体共同表达,可用于阳性细胞流式筛选与鉴定。
 
五、构建的载体可以含有完整MiRNA基因簇,可用于高通量表型筛选研究。
 
六、含有多种优势元件:
       3 ΔLTR (ΔU3)
       3’ LTR区域删除了U3,使其不再有启动/增强活性,成为自灭活(self-inactivating, SIN) 载体,即整合到细胞基因组后,不会产生新的子代病毒,也降低了对周围基因的意外激活。
       copGFP
绿色荧光报告基因,与常用的EGFP类似,但荧光更亮。
       Zeo抗性基因
阳性细胞筛选。
       pUC起始点
使质粒在 E.coli 中高密度拷贝并且保持稳定。
       RSV/5’LTR RSV杂交启动子-R/U5’长末端重复序列
让全长病毒在293前体细胞中高水平包装和转录表达。
       CMV/5’LTR CMV杂交型启动子-R/U5长末端重复序列)
使慢病毒载体保持高水平转录和高效转录出含病毒包装必需功能元件(如Psi, RRE, and cPPT等)的转录本,当用病毒包装细胞系(如HEK 293细胞)包装病毒时也能表达病毒衣壳蛋白。
       SV40起始点
使质粒在哺乳动物细胞中稳定复制。
       SV40多聚A加尾信号
强制转录终止子,有效终止转录或者终止共转录过程,维持稳定态mRNA高水平表达。
       LCS无连接酶克隆位点
不依赖多克隆位点,能将各种目的microRNA插入载体,不需要DNA链接酶,较常规方法可靠。
       WPRE元件
增强CMV启动转录的稳定性。
 
说明:每种载体用的优势元件均有所不同 
  
客制化服务方案:
             
  目前我们能够为客户提供包括miRNA表达谱分析、慢病毒载体构建、测序、慢病毒生产等一站式服务。我们的服务将为客户最大限度地提高效率和节省时间。另外,我们的技术专家将为您的实验提供全程支持,请Email至yanggy@genechem.com
  同时,我们为客户提供miRNA过表达慢病毒载体构建服务的个性化定制服务方案,包括根据miRNA特征、目的细胞特征与客户需求,我们会为客户选择最合适的慢病毒载体、启动子、荧光标记或选择性抗性标记,插入pri-miRNA或miRNA基因簇使其过表达,客户也可以根据我们的载体信息自行挑选;同时又可以根据客户的需要,可在重组慢病毒载体中加入各种报告基因或标签(或进行改造),从而构建miRNA过表达慢病毒载体。
  我们有标准的客制化服务流程,同时我们也会根据客户需求,为每个客户度身定制各种MicroRNA慢病毒载体构建服务方案。如有需要,欢迎致电021-34512321咨询。
 
 
标准客制化服务流程:
 
microRNA过表达载体构建服务列表:
 
  我们可以根据客户需求构建各种浓度的超纯纯化miRNA过表达慢病毒载体,能被包装成miRNA过表达慢病毒颗粒;无内源性多聚A信号;对靶细胞无毒;从5 to 3 LTR序列大小大于8kb;可直接转染细胞,用于瞬时转染;也可以包装成病毒颗粒,用于稳定长效表达。
 
超纯纯化标准:
                   内毒素<10EU/mg质粒DNA
                   RNA<0.2ug/mg
                   基因组DNA<2ug/mg
                   蛋白<3ug/mg 
 
      编号
cDNA过表达慢病毒载体构建
标准
工作日
C200001
10 μg
超纯纯化
10
C200002
20 μg
超纯纯化
10
C200003
40 μg
超纯纯化
10
 
 
 
 
 
 
 
 
表达出的MicroRNA是内源性MicroRNA的几倍:
  用HIV来源的慢病毒载体构建的MicroRNA Lenti-miR载体包装成病毒颗粒之后,感染HEK293细胞,表达的MicroRNA用qPCR检测,结果发现用我们的过表达载体表达出MicroRNA是内源性MicroRNA的几倍以上。
 
  
共表达microRNA基因簇:
  microRNA(miRNA)基因簇是一类miRNA基因在染色体上成簇排列形成的基因群. 在动植物基因组中,已发现存在大量簇生排列的miRNA基因。然而这种簇生排列方式所具有的功能意义尚不完全清楚. miRNA基因簇常位于一个多顺反子内, 通过共表达在胚胎发育、细胞周期、肿瘤发生、细胞分化等诸多方面发挥协同调控的功能。
  详细的构建服务流程及其他信息请见上述microRNA慢病毒载体构建服务内容。
 
肿瘤和干细胞MicroRNA基因簇:
 
 
乳腺癌肿瘤干细胞MicroRNA基因簇:
 
 
 
成功案例:
 
miR-10b construct cloned using Clone-it microRNA Cloning System was transiently transfected into 293 cells with the indicated amount of plasmid DNA.  Mature miR-10b was measured using qPCR
  
 
参考文献: 
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