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shRNA慢病毒包装服务
一、慢病毒包装服务介绍：
我们采用第三代慢病毒载体系统（详见 慢病毒载体信息），病毒颗粒包膜上嵌合了来自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多种细胞（包括分裂、非分裂细胞、难以转染的细胞）、模式动物、活体实验，且表达更趋稳定。
shRNA慢病毒载体,最给力的RNAi工具：
在 siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA； 也可由载体直接表达发卡结构小干扰RNA (small hairpin RNA, shRNA)。通过构建RNAi慢病毒颗粒制备shRNA，已成为进行RNA干扰实验的最常用手段之一。 目前为了感染原代细胞和难感染的细胞系或者在动物水平进行RNAi，研究科学家更多的选择了慢病毒载体。利用shRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，shRNA慢病毒颗粒可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
shRNA慢病毒颗粒具有以下优势：
转染效率高且可以转导入绝大多数细胞
shRNA慢病毒能用于分化细胞或静息型哺乳动物细胞的转染，包括难于转染的原代细胞、干细胞、神经细胞和内皮细胞等，另外，我们的载体也可以用于knockdow动物和转基因小鼠。
更好地分析目的基因的特点
与化学合成的siRNA相比， 利用shRNA慢病毒转染细胞后能够避免合成的siRNA非有效转染造成的残余和损伤。慢病毒带来的高效和无压力转染极大提高了目的基因沉默后表型分析的likelihood值。
长久性与可遗传型RNA干扰
shRNA慢病毒感染细胞后可以整合到受感染细胞的基因组，稳定长效表达miRNA, 这种RNA干扰具有可遗传性，以便用于筛选稳定细胞模型用于长期的研究和观察。
慢病毒包装简要流程：
1、根据目的基因相关信息构建shRNA重组慢病毒载体，提取和纯化成超纯纯化重组质粒；
2、使用重组载体和病毒包装质粒共转染293TN 细胞，培养48 -72小时左右，进行病毒包装和生产，收集病毒液；
3、纯化和浓缩病毒液；
4、病毒滴度测定、目的基因检定
慢病毒转染效率：
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验。
高度安全：
我们的慢病毒颗粒将生物安全性保证到了最大程度，其中HIV-1来源的pSIH系列shRNA慢病毒载体来源于能用于美国临床基因治疗的慢病毒， 专利号位美国Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。
3 ΔLTR (ΔU3)
3’ LTR区域删除了U3，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体，即整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活。
RSV/5’LTR （RSV杂交启动子-R/U5’长末端重复序列）
采用杂合型RSV的增强子/启动子-R/U5’长末端重复序列，这样病毒转录时不依赖tat的存在，去除了 HIV的tat基因表达。，tat在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用
慢病毒骨架设计
仅保留了三个HIV-1病毒包装、复制与转导必需基因（gag, pol, rev) ，因其缺乏HIV-1增强子启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出HIV RNA
慢病毒颗粒中无HIV-1基因
因为HIV-1表达的包装质粒都缺乏包装信息，所以，慢病毒颗粒不具有复制能力
假病毒颗粒
慢病毒颗粒实为假病毒颗粒，只表达目的基因
水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜
限制慢病毒成为野生型的可能性
二、我们的服务优势：
客制化载体构建方案：
我们的服务方案包括根据目的基因特征以及要转染细胞的特征与客户需求，我们会为客户选择最合适的慢病毒载体、启动子、荧光标记或选择性抗性标记，插入目的基因使其过表达，客户也可以根据我们的载体信息自行挑选；同时又可以根据客户的需要，可在重组慢病毒载体中加入各种报告基因或标签（或进行改造），从而构建高质量的shRNA慢病毒载体，请参见 shRNA慢病毒载体构建服务。
多种慢病毒载体系统可供选择：
我们用于shRNA慢病毒载体至少有十种以上可供客选择，根据参考文献以及目的应用，我们总能帮客户找到最合适实验目的的载体系统，而且每种慢病毒载体都具有相应的文献可追溯性（请参见 慢病毒载体信息）。
更合理、省心的服务流程：
我们会根据每个客户的情况，为客户独身定制相应的的服务流程，相比较而言，我们会根据客户的实验目的，查阅大量的文献以作参考；大规模包装之前，会先小试，再在细胞水平验证目的基因， 并且会跟客户确认，让技术服务更合理；客户只需要告诉我们目的序列信息和细胞信息，我们会完成所有的服务，最后也提供相应的数据和资料，让客户更省心。
我们有以下标准服务方案如下，但是具体的实验方案需要根据实际情况而定制，这里的标准流程仅供参考：
慢病毒浓缩：
我们使用SBI公司的PEG-it不会积累细胞残片，避免了毒性和免疫反应，对包括ES细胞在内的所有靶细胞无毒。超速离心的过程中，也会浓缩其他杂质，如细胞碎片、膜片段、以及细胞培养基内的变性蛋白等。这些杂质对于病毒颗粒的后继操作是有害的，如降低细胞转染效率，对转染细胞的细胞毒性等，特别是当转染原代细胞的时候。同时应用于试验动物的时候，会引发免疫反应，因此在慢病毒的应用过程中，不但需要较高的滴度，较高的纯度也是很重要的。
慢病毒包装服务储存计划：
我们会为客户将定制好的慢病毒颗粒及载体做额外备份，免费储存一段时间。以免客户在后面的实验中发生意外而急需。如有需要，也可以更优惠的价格再次订购。，详情请参见慢病毒包装服务储存计划。
技术力量：
我们的主要生产人员均为博士后或博士，我们生产人员常规包装的慢病毒包装颗粒滴度均在>10^9 IFUs/ml以上。
三、cDNA过表达慢病毒包装服务列表：
cDNA过表达慢病毒包装服务列表：
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编号 |
慢病毒产量 |
可提供慢病毒数量 |
工作日 |
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P200001 |
>1*10^7 IFUs/ml（常规滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P200002 |
>5*10^7 IFUs/ml（常规滴度） |
>5*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P200003 |
>1*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P200004 |
>2*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>2*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P200005 |
>4*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>4*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P200006 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，体内实验、干细胞应用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
30 |
说明：FIV来源的载体只能包装成常规滴度的慢病毒
对照慢病毒颗粒：
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服务编号 |
对照慢病毒产量 |
可提供慢病毒数量 |
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P200007 |
>1*10^7 IFUs/ml（常规滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
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P200008 |
>1*10^8 IFUs/ml（常规滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
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P200009 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，体内实验、干细胞应用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
*用cDNA过表达病毒颗粒做对照，请详见cDNA基因过表达慢病毒包装服务。
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编号 |
shRNA慢病毒载体阴性对照 |
标准 |
主要特征 |
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S200008 |
pGreenPuro Scramble Hairpin Control |
10 μg超纯纯化 |
GFP和Puro双标签 |
四、成功案例与参考文献：
成功案例：
HEK-293 cells were transfected with either pSIH1-H1-copGFP or pGreenPuro™ shRNA expression vector, and puromycin (8 – 50 ug/ml final concentration) was then added to the cells 24 hours after transfection. The pictures were taken 24 hour after the initiation of the puromycin treatment.
参考文献：
13、Yonghui Zhang, Xiaojing Lin, Guoqin Wang, Jianfang Zhou, Jian Lu, Honglan Zhao, Fengwei Zhang, Jia Wu, Chunqiong Xu, Ning Du, Zi Li, Ye Zhang, Xiaoyi Wang, Shengli Bi, Yuelong Shu, Hongning Zhou, Wenjie Tan, Xiaobing Wu, Zhihui Chen, Yue Wang. Neuraminidase and Hemagglutinin Matching Patterns of a Highly Pathogenic Avian and Two Pandemic H1N1Influenza A Viruses. PLoS One. 2010; 5(2): e9167. PDF>>>14、Ning Sun, Nicholas J. Panetta, Deepak M. Gupta, Kitchener D. Wilson, Andrew Lee, Fangjun Jia, Shijun Hu, Athena M. Cherry, Robert C. Robbins, Michael T. Longaker, and Joseph C. Wu. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 September 15; 106(37): 15720–15725. PDF>>> |
