MicroRNA knockdown慢病毒包装服务
一、慢病毒包装服务介绍：
MicroRNA（miRNA）即为长度为22nt左右的非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在于真核生物中，不具有开放阅读框架，不编码蛋白质，一般长20-24nt，miRNA的转录产物是发夹状结构Pri-miRNA，在RNaseⅢ酶切后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。成熟的miRNA 侧翼序列则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA基因是一类高度保守的基因家族，表达具有时序性和组织特异性。miRNA对生长发育进行更为重要的调控作用。同时，科学家们也发现人类基因组中大约有255个编码miRNA基因，约占人类基因数的1%，但尚不清楚其功能。最近科学家发现小RNA 与‘epigenetic’现象有联系。所谓epigenetic是指并不涉及遗传序列的特征性的遗传改变。有人已试图将小RNA 用于抗病毒治疗之用,认为它们有可有可能抑制HIV21 和灰质类病毒丙型肝炎病毒的转录,以及也可能用于肿瘤的治疗。
我们采用第三代慢病毒载体系统（详见 慢病毒载体信息），能够高效表达出高效表达出不对称发夹装结构shRNA，这种shRNA能生成MicroRNA抑制剂，能特异性抑制内源性microRNA的功能。病毒颗粒包膜上嵌合了来自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多种细胞（包括分裂、非分裂细胞、难以转染的细胞）、模式动物、活体实验，而且表达更趋稳定。
高效表达miRNA抑制剂：
1、含组成型H1启动子，持久且稳定表达MicroRNA抑制剂.，实现永久性MicroRNA knockdown效应。
2、由于microRNA慢病毒载体能够被包装成microRNA慢病毒颗粒，用于感染分裂期和非分裂期细胞，如原代细胞、难于转染的细胞或干细胞等。
3、这种MicroRNA knockdown效应能够传代，特别适合药物筛选细胞株、病理组织与转基因动物研究。
4、能够明显特异性抑制内源性MicroRNA的表达。
5、copGFP与Puro双标签形式，可用于稳定阳性细胞株流式或抗性筛选。
6、MicroRNA抑制表达载体文库可用于高通量表型筛选研究。
miRNA Knockdown原理：
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我们使用的载体能持续表达目的shRNA， 这种shRNA的上下部分不完全对称（如下图），上部分（灰色）不包含内源性miRNA， 而下部分经过剪切之后成短的、单链的microRNA抑制剂，能与内源性microRNA的靶mRNA序列完全互补结合，竞争性地抑制内源性microRNA的调节功能，从而使蛋白表达水平上调等。 |
慢病毒包装简要流程：
1、根据目的基因相关信息构建shRNA重组慢病毒载体，提取和纯化成超纯纯化重组质粒；
2、使用重组载体和病毒包装质粒共转染293TN 细胞，培养48 -72小时左右，进行病毒包装和生产，收集病毒液；
3、纯化和浓缩病毒液；
4、病毒滴度测定、目的基因检定
高度安全：
我们的慢病毒颗粒将生物安全性保证到了最大程度，其中HIV-1来源的pSIH系列shRNA慢病毒载体来源于能用于美国临床基因治疗的慢病毒， 专利号位美国Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。
3 ΔLTR (ΔU3)
3’ LTR区域删除了U3，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体，即整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活。
RSV/5’LTR （RSV杂交启动子-R/U5’长末端重复序列）
采用杂合型RSV的增强子&, lt;, /SPAN>/启动子-R/U5’长末端重复序列，这样病毒转录时不依赖tat的存在，去除了 HIV的tat基因表达。，tat在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用
慢病毒骨架设计
仅保留了三个HIV-1病毒包装、复制与转导必需基因（gag, pol, rev) ，因其缺乏HIV-1增强子启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出HIV RNA
慢病毒颗粒中无HIV-1基因
因为HIV-1表达的包装质粒都缺乏包装信息，所以，慢病毒颗粒不具有复制能力
假病毒颗粒
慢病毒颗粒实为假病毒颗粒，只表达目的基因
水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜
限制慢病毒成为野生型的可能性
二、我们的服务优势：
客制化载体构建方案：
我们的服务方案包括根据目的基因特征以及要转染细胞的特征与客户需求，我们会为客户选择最合适的慢病毒载体、启动子、荧光标记或选择性抗性标记，插入目的基因使其过表达，客户也可以根据我们的载体信息自行挑选；同时又可以根据客户的需要，可在重组慢病毒载体中加入各种报告基因或标签（或进行改造），从而构建高质量的MicroRNA knockdown慢病毒载体，请参见 microRNA knockdown慢病毒载体构建服务。
慢病毒载体优化系统：
我们用于microRNA knockdown慢病毒载体有多种优化过的优势元件，如T2A肽链，同时表达GFP和Puro两个标签，既可以用于流式筛选，也可以用于抗性筛选，根据参考文献以及目的应用，我们总能帮客户找到最合适的实验方案，而且我们的慢病毒载体都具有相应的文献可追溯性。
更合理、省心的服务流程：
我们会根据每个客户的情况，为客户独身定制相应的的服务流程，相比较而言，我们会根据客户的实验目的，查阅大量的文献以作参考；大规模包装之前，会先小试，再在细胞水平验证目的基因， 并且会跟客户确认，让技术服务更合理；客户只需要告诉我们目的序列信息和细胞信息，我们会完成所有的服务，最后也提供相应的数据和资料，让客户更省心。
标准服务流程如下，仅供参考：
慢病毒浓缩：
我们使用SBI公司的PEG-it不会积累细胞残片，避免了毒性和免疫反应，对包括ES细胞在内的所有靶细胞无毒。超速离心的过程中，也会浓缩其他杂质，如细胞碎片、膜片段、以及细胞培养基内的变性蛋白等。这些杂质对于病毒颗粒的后继操作是有害的，如降低细胞转染效率，对转染细胞的细胞毒性等，特别是当转染原代细胞的时候。同时应用于试验动物的时候，会引发免疫反应，因此在慢病毒的应用过程中，不但需要较高的滴度，较高的纯度也是很重要的。
慢病毒包装服务储存计划：
我们会为客户将定制好的慢病毒颗粒及载体做额外备份，免费储存一段时间。以免客户在后面的实验中发生意外而急需。如有需要，也可以更优惠的价格再次订购，详情请至慢病毒包装服务储存计划。
技术力量：
我们的主要生产人员均为博士后或博士，我们生产人员常规包装的慢病毒包装颗粒滴度均在>10^9 IFUs/ml以上。
三、MicroRNA knockdown慢病毒包装服务列表
miRNA Knockdown慢病毒包装服务列表：
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编号 |
慢病毒产量 |
可提供慢病毒数量 |
工作日 |
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P400001 |
>1*10^7 IFUs/ml（常规滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P400002 |
>5*10^7 IFUs/ml（常规滴度） |
>5*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P400003 |
>1*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P400004 |
>2*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>2*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P400005 |
>4*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>4*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P400006 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，体内实验、干细胞应用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
30 |
说明：FIV来源的载体只能包装成常规滴度的慢病毒
对照慢病毒颗粒：
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服务编号 |
pGreenPuro Scramble Hairpin Control |
可提供慢病毒数量 |
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P100007 |
>1*10^7 IFUs/ml（常规滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
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P100008 |
>1*10^8 IFUs/ml（常规滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
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P100009 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，体内实验、干细胞应用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
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*用MicroRNA过表达病毒颗粒做对照，请详见MicroRNA过表达慢病毒包装服务。
高水平表达miRNA抑制剂：
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miRZip重组载体表达高水平miRNA抑制剂
为了验证microRNA重组载体的miRNA抑制剂表达水平，六种3μg载体转染至HEK293细胞。培养48小时候之后，裂解细胞和提取总RNA，RNA样本反转录成cDNA，最后用qPCR方法分析miRNA抑制剂的表达水平。
用qPCR验证表达miRNA抑制剂的水平
反转录的cDNA 1:50稀释，取1μl再加引物等制备成6μl qPCR反应体系，未转染载体的细胞作为阴性对照，结果如左图所示。
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四、成功案例与参考文献
成功案例：
案例一：
miRNA抑制剂表达载体转染HEK-293细胞，培养24小时之后加入8-50 μg/ml终浓缩嘌呤霉素，加入 嘌呤霉素24小时之后的结果如上图所示，对照细胞在嘌呤霉素筛选全部死亡。
案例二：
用Lenti-miR-29a（过表达）慢病毒、miRZip-29a（Knockdown）慢病毒和阴性对照感染U937细胞，用WB检测目标蛋白的表达水平，如下图所示：miR-29的过表达下调目标蛋白；miRZip-29a抑制内源性miR-29a的表达，明显上调目标蛋白表达水平。
案例三：
为了研究miR-21(癌基因发生相关miRNA)和miR-145（抑制肿瘤相关miRNA）在乳腺癌中表达的意义，分别用miRZip-21慢病毒、miRZip-145慢病毒与对照慢病毒感染MDA-MB-231乳腺癌细胞，再用Matrigel做细胞浸润实验来检测MDA-MB-231乳腺癌细胞的浸润表型。
20小时之后，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定并0.05%结晶紫染色，显微镜下直接观察穿过膜的细胞数。下图分别为对照病毒、miRZip-21 knockdown慢病毒和 miRZip-145 knockdown慢病毒处理过的穿过膜细胞视野图。
实验结果表明：对阴性对照相比，miRZip-21 knockdown慢病毒表达mir-21抑制剂能抑制80%的癌细胞生成；而miRZip-145能促进60%癌细胞生成。另外， miRZip-145慢病毒表达抑制内源性miRZip-145从而调节靶蛋白癌基因c-Myc的表达，WB结果如下图所示：
参考文献：
13、Yonghui Zhang, Xiaojing Lin, Guoqin Wang, Jianfang Zhou, Jian Lu, Honglan Zhao, Fengwei Zhang, Jia Wu, Chunqiong Xu, Ning Du, Zi Li, Ye Zhang, Xiaoyi Wang, Shengli Bi, Yuelong Shu, Hongning Zhou, Wenjie Tan, Xiaobing Wu, Zhihui Chen, Yue Wang. Neuraminidase and Hemagglutinin Matching Patterns of a Highly Pathogenic Avian and Two Pandemic H1N1Influenza A Viruses. PLoS One. 2010; 5(2): e9167. PDF>>>14、Ning Sun, Nicholas J. Panetta, Deepak M. Gupta, Kitchener D. Wilson, Andrew Lee, Fangjun Jia, Shijun Hu, Athena M. Cherry, Robert C. Robbins, Michael T. Longaker, and Joseph C. Wu. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 September 15; 106(37): 15720–15725. PDF>>> |
