MicroRNA过表达慢病毒包装服务
一、慢病毒包装服务介绍：
MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。
我们采用第三代慢病毒载体系统（详见 慢病毒载体信息），能够高效表达出原始天然pri-miRNA和MicroRNA基因簇。病毒颗粒包膜上嵌合了来自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多种细胞（包括分裂、非分裂细胞、难以转染的细胞）、模式动物、活体实验，而且表达更趋稳定。
高效表达出天然pri-miRNA和MiRNA基因簇：
1、含CMV启动子高效表达出原始天然pri-miRNA，我们从人、大鼠、小鼠基因组或肿瘤组织中克隆出pri-miRNA，完全忠实细胞内的天然结构，具有更高的效率，更重要的是，它能在细胞内准确无误地表达出天然microRNA。
2、随着成千上万条miRNA被鉴定出来，用microRNA干预基因功能或药物筛选的需求越来越多。由于microRNA慢病毒颗粒能用于感染分裂期和非分裂期细胞，如原代细胞、难于转染的细胞或干细胞等，使其成为活体研究甚至基因治疗的里程碑。
3、microRNA慢病毒颗粒感染过的细胞能够长久表达miRNA，且这种表达具有可遗传性，与化学合成的miRNA或表达miRNA质粒实现的瞬时表达相比，这种特点与天然的microRNA机制更相似。
4、copGFP与miRNA前体共同表达，可用于阳性细胞流式筛选与鉴定。
5、慢病毒可以表达完整MiRNA基因簇，可用于高通量表型筛选研究。
慢病毒包装简要流程：
1、根据目的基因相关信息构建cDNA过表达重组慢病毒载体，提取和纯化成超纯纯化重组质粒；
2、使用重组载体和病毒包装质粒共转染293TN 细胞，培养48 -72小时左右，进行病毒包装和生产，收集病毒液；
3、纯化和浓缩病毒液；
4、病毒滴度测定、目的基因检定
慢病毒转染效率：
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验。
高度安全：
我们的慢病毒颗粒将生物安全性保证到了最大程度，其中HIV-1来源的pSIH系列shRNA慢病毒载体来源于能用于美国临床基因治疗的慢病毒，专利号位美国Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。
3 ΔLTR (ΔU3)
3’ LTR区域删除了U3，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体，即整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活。
RSV/5’LTR （RSV杂交启动子-R/U5’长末端重复序列）
采用杂合型RSV的增强子/启动子-R/U5’长末端重复序列，这样病毒转录时不依赖tat的存在，去除了 HIV的tat基因表达。，tat在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用
慢病毒骨架设计
仅保留了三个HIV-1病毒包装、复制与转导必需基因（gag, pol, rev) ，因其缺乏HIV-1增强子启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出HIV RNA
慢病毒颗粒中无HIV-1基因
因为HIV-1表达的包装质粒都缺乏包装信息，所以，慢病毒颗粒不具有复制能力
假病毒颗粒
慢病毒颗粒实为假病毒颗粒，只表达目的基因
水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜
限制慢病毒成为野生型的可能性
二、我们的服务优势：
客制化载体构建方案：
我们服务方案包括根据目的基因特征以及要转染细胞的特征与客户需求，我们会为客户选择最合适的慢病毒载体、启动子、荧光标记或选择性抗性标记，插入目的基因使其过表达，客户也可以根据我们的载体信息自行挑选；同时又可以根据客户的需要，可在重组慢病毒载体中加入各种报告基因或标签（或进行改造），从而构建高质量的MicroRNA过表达慢病毒载体，请参见 MicroRNA慢病毒载体构建服务。
多种慢病毒载体系统可供选择：
我们用于shRNA过表达的慢病毒载体有六种可供客选择，根据参考文献以及目的应用，我们总能帮客户找到最合适实验目的的载体系统，而且每种慢病毒载体都具有相应的文献可追溯性。
更合理、省心的服务流程：
我们会根据每个客户的情况，为客户独身定制相应的的服务流程，相比较而言，我们会根据客户的实验目的，查阅大量的文献以作参考；大规模包装之前，会先小试，再在细胞水平验证目的基因， 并且会跟客户确认，让技术服务更合理；客户只需要告诉我们目的序列信息和细胞信息，我们会完成所有的服务，最后也提供相应的数据和资料，让客户更省心。
标准服务流程如下，仅供参考：
慢病毒浓缩：
我们使用SBI公司的PEG-it不会积累细胞残片，避免了毒性和免疫反应，对包括ES细胞在内的所有靶细胞无毒。超速离心的过程中，也会浓缩其他杂质，如细胞碎片、膜片段、以及细胞培养基内的变性蛋白等。这些杂质对于病毒颗粒的后继操作是有害的，如降低细胞转染效率，对转染细胞的细胞毒性等，特别是当转染原代细胞的时候。同时应用于试验动物的时候，会引发免疫反应，因此在慢病毒的应用过程中，不但需要较高的滴度，较高的纯度也是很重要的。
慢病毒包装服务储存计划：
我们会为客户将定制好的慢病毒颗粒及载体做额外备份，免费储存一段时间。以免客户在后面的实验中发生意外而急需。如有需要，也可以更优惠的价格再次订购。详情请参见慢病毒包装服务储存计划。
技术力量：
我们的主要生产人员均为博士后或博士，我们生产人员常规包装的慢病毒包装颗粒滴度均在>10^9 IFUs/ml以上。
三、cDNA过表达慢病毒包装服务列表：
cDNA过表达慢病毒包装服务列表：
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编号 |
慢病毒产量 |
可提供慢病毒数量 |
工作日 |
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P300001 |
>1*10^7 IFUs/ml（常规滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P300002 |
>5*10^7 IFUs/ml（常规滴度） |
>5*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P300003 |
>1*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P300004 |
>2*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>2*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P300005 |
>4*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>4*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P300006 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，体内实验、干细胞应用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
30 |
说明：FIV来源的载体只能包装成常规滴度的慢病毒
对照慢病毒颗粒：
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服务编号 |
对照慢病毒产量 |
可提供慢病毒数量 |
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P100007 |
>1*10^7 IFUs/ml（常规滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
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P100008 |
>1*10^8 IFUs/ml（常规滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
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P100009 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，体内实验、干细胞应用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
*用MicroRNA knockdown病毒颗粒做对照，请详见MicroRNA knockdown慢病毒包装服务。
表达出的MiRNA是内源性MiRNA的几倍：
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用HIV来源的Lenti-miR MicroRNA过表达载体包装成病毒颗粒之后，感染HEK293细胞，表达的MicroRNA用qPCR检测，结果发现用我们的慢病毒表达出MicroRNA是内源性MicroRNA的几倍以上。 |
共表达MiRNA基因簇：
microRNA(miRNA)基因簇是一类miRNA基因在染色体上成簇排列形成的基因群. 在动植物基因组中，已发现存在大量簇生排列的miRNA基因。然而这种簇生排列方式所具有的功能意义尚不完全清楚. miRNA基因簇常位于一个多顺反子内, 通过共表达在胚胎发育、细胞周期、肿瘤发生、细胞分化等诸多方面发挥协同调控的功能。
肿瘤和干细胞MicroRNA基因簇：
乳腺癌肿瘤干细胞MicroRNA基因簇：
四、成功案例与参考文献：
13、Yonghui Zhang, Xiaojing Lin, Guoqin Wang, Jianfang Zhou, Jian Lu, Honglan Zhao, Fengwei Zhang, Jia Wu, Chunqiong Xu, Ning Du, Zi Li, Ye Zhang, Xiaoyi Wang, Shengli Bi, Yuelong Shu, Hongning Zhou, Wenjie Tan, Xiaobing Wu, Zhihui Chen, Yue Wang. Neuraminidase and Hemagglutinin Matching Patterns of a Highly Pathogenic Avian and Two Pandemic H1N1Influenza A Viruses. PLoS One. 2010; 5(2): e9167. PDF>>>14、Ning Sun, Nicholas J. Panetta, Deepak M. Gupta, Kitchener D. Wilson, Andrew Lee, Fangjun Jia, Shijun Hu, Athena M. Cherry, Robert C. Robbins, Michael T. Longaker, and Joseph C. Wu. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 September 15; 106(37): 15720–15725. PDF>>> |
