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microRNA knockdown慢病毒载体构建服务
microRNA knockdown慢病毒载体构建服务
 
MicroRNAsiRNA     
  MicroRNA(miRNA)即为长度为22nt左右的非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在于真核生物中,不具有开放阅读框架,不编码蛋白质,一般长20-24nt,miRNA的转录产物是发夹状结构Pri-miRNA,在RNaseⅢ酶切后以双链形式存在,最后释放互补链,miRNA成熟。成熟的miRNA 侧翼序列则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA基因是一类高度保守的基因家族,表达具有时序性和组织特异性。miRNA对生长发育进行更为重要的调控作用。同时,科学家们也发现人类基因组中大约有255个编码miRNA基因,约占人类基因数的1%,但尚不清楚其功能。最近科学家发现小RNA 与‘epigenetic’现象有联系。所谓epigenetic 是指并不涉及遗传序列的特征性的遗传改变。有人已试图将小RNA 用于抗病毒治疗之用,认为它们有可能抑制HIV21 和灰质类病毒丙型肝炎病毒的转录,以及也可能用于肿瘤的治疗。
 
miRNAsiRNA之间有许多相同之处:
1、二者的长度都约在22nt左右。
2、二者都依赖Dicer酶的加工,是Dicer的产物,所以具有Dicer产物的特点。
3、二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。
4、二者都是RISC组分,所以其功能界限变得不清晰,如二者在介导沉默机制上有重叠。
5、miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。
 
miRNAsiRNA的不同点:
1、根本区别是miRNA是内源的,是生物体的固有因素;而siRNA是人工体外合成的,通过转染进入人体内,是RNA干涉的中间产物。
2、结构上,miRNA是单链RNA,而siRNA是双链RNA。
3、Dicer酶对二者的加工过程不同,miRNA是不对称加工,miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂,其他部分降解;而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。
4、在作用位置上,miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区,而siRNA可作用于mRNA的任何部位。
5、在作用方式上,miRNA可抑制靶标基因的翻译,也可以导致靶标基因降解,即在转录水平后和翻译水平起作用,而siRNA只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控。
6、miRNA主要在发育过程中起作用,调节内源基因表达,而siRNA不参与生物生长,是RNAi的产物,原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
 
 
MicroRNA knockdown慢病毒载体特点:
  我们采用美国进口的第三代microRNA抑制表达慢病毒表达载体,能够高效表达出不对称发夹装结构shRNA,这种shRNA能生成 MicroRNA抑制剂,能特异性抑制内源性microRNA的功能,详情请见慢病毒载体信息
 
MicroRNA knockdown慢病毒载体具有以下特点:
1、含组成型H1启动子,持久且稳定表达MicroRNA抑制剂.,实现永久性MicroRNA knockdown效应。
2、由于microRNA慢病毒载体能够被包装成microRNA慢病毒颗粒,用于感染分裂期和非分裂期细胞,如原代细胞、难于转染的细胞或干细胞等。
3、这种MicroRNA knockdown效应能够传代,特别适合药物筛选细胞株、病理组织与转基因动物研究。
4、能够明显特异性抑制内源性MicroRNA的表达。
5、copGFP与Puro双标签形式,可用于稳定阳性细胞株流式或抗性筛选。
6、MicroRNA抑制表达载体文库可用于高通量表型筛选研究。
 
MicroRNA Knockdown载体原理:
      
 
 
 
 
 
我们使用的载体能持续表目的shRNA, 这种shRNA的上下部分不完全对称,如左图, 上部分(灰色)不包含内源性miRNA, 而下部分经过剪切之后成短的、单链的microRNA抑制剂,能与内源性microRNA的靶mRNA序列完全互补结合,竞争性地抑制内源性microRNA的调节功能,从而使蛋白表达水平上调等。
客制化服务方案:
  目前我们能够为客户提供包括miRNA表达谱分析、慢病毒载体构建、测序、慢病毒生产等一站式服务。我们的服务将为客户最大限度地提高效率和节省时间。另外,我们的技术专家将为您的实验提供全程支持,请Email至yanggy@genechem.com.cn
  同时,我们为客户提供miRNA抑制表达慢病毒载体构建服务的个性化定制服务方案,包括根据miRNA抑制序列、mRNA特征、目的细胞特征与客户需求,我们会为客户选择最合适的慢病毒载体、启动子、荧光标记或选择性抗性标记,插入miRNA抑制序列,使其大量表达,客户也可以根据我们的载体信息自行挑选;同时又可以根据客户的需要,可在重组慢病毒载体中加入各种报告基因或标签(或进行改造),从而构建miRNA knockdown慢病毒载体。
  我们有标准的客制化服务流程,同时我们也会根据客户需求,为每个客户度身定制各种MicroRNA knockdown慢病毒载体构建服务方案。如有需要,欢迎致电021-34512321咨询。
 
标准客制化服务流程:
 
 
MicroRNA knockdown慢病毒载体构建服务列表:
  我们可以根据客户需求构建各种浓度的超纯纯化miRNA抑制表达慢病毒载体。构建的重组miRNA抑制表达慢病毒载体可直接转染细胞,用于瞬时转染;也可以包装成病毒颗粒,用于稳定长效表达。
 
超纯纯化标准:
                   内毒素<10EU/mg质粒DNA
                   RNA<0.2ug/mg
                   基因组DNA<2ug/mg
                   蛋白<3ug/mg
 
      编号
miRNA knockdown慢病毒载体构建
标准
工作日
C200001
10 μg
超纯纯化
10
C200002
20 μg
超纯纯化
10
C200003
40 μg
超纯纯化
10
 
 
 
 
 
 
shRNA knokcdown慢病毒载体阴性对照: 
编号
miRNA knockdown慢病毒载体阴性对照
标准
主要特征
S200008
pGreenPuro Scramble Hairpin Control
10 μg超纯纯化
GFP和Puro双标签
 
 
高水平表达miRNA抑制剂:
 
 
 
miRZip重组载体表达高水平miRNA抑制剂
 
 为了验证microRNA重组载体的miRNA抑制剂表达水平,六种3μg载体转染至HEK293细胞。培养48小时候之后,裂解细胞和提取总RNA,RNA样本反转录成cDNA,最后用qPCR方法分析miRNA抑制剂的表达水平。
 
 
qPCR验证表达miRNA抑制剂的水平
 
反转录的cDNA 1:50稀释,取1μl再加引物等制备成6μl qPCR反应体系,未转染载体的细胞作为阴性对照,结果如左图所示。
 
 
 
感染细胞最佳MOI的测定:
  MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)是指每个细胞感染的病毒数,通常MOI越高,病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞,比如Hela、293细胞,MOI=1时,80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞,比如原代细胞,感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI(比如0、1、5、10、50、100等),选择适合的MOI进行实验。
 
慢病毒转染效率:
 
 
 
成功案例:
 
案例一:
 
 
 
 
 
 
 
miRNA抑制剂表达载体转染HEK-293细胞,培养24小时之后加入8-50 μg/ml终浓缩嘌呤霉素,加入 嘌呤霉素24小时之后的结果如左图所示,对照细胞在嘌呤霉素筛选全部死亡。
 
 
 
案例二:
 
用Lenti-miR-29a(过表达)慢病毒、miRZip-29a(Knockdown)慢病毒和阴性对照感染U937细胞,用WB检测目标蛋白的表达水平,如左图所示:miR-29的过表达下调目标蛋白;miRZip-29a抑制内源性miR-29a的表达,明显上调目标蛋白表达水平。
 
 
 
 
案例三:
 
 
为了研究miR-21(癌基因发生相关miRNA)和miR-145(抑制肿瘤相关miRNA)在乳腺癌中表达的意义,分别用miRZip-21慢病毒、miRZip-145慢病毒与对照慢病毒感染MDA-MB-231乳腺癌细胞,再用Matrigel做细胞浸润实验来检测MDA-MB-231乳腺癌细胞的浸润表型。
 
 
 
 
 
 
20小时之后,将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定并0.05%结晶紫染色,显微镜下直接观察穿过膜的细胞数。右图分别为对照病毒、miRZip-21 knockdown慢病毒和 miRZip-145 knockdown慢病毒处理过的穿过膜细胞视野图。
 
 
 
 
 
 
 
 
实验结果表明:对阴性对照相比,miRZip-21 knockdown慢病毒表达mir-21抑制剂能抑制80%的癌细胞生成;而miRZip-145能促进60%癌细胞生成。另外, miRZip-145慢病毒表达抑制内源性miRZip-145从而调节靶蛋白癌基因c-Myc的表达,WB结果如图所示:
 
参考文献
 
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